如何通過化學修飾提高mRNA的穩定性和效率？

德國科隆大學的研究人員提出了一種對mRNA進行雙重化學修飾的策略，并評估了這些修飾對mRNA功能的影響。

從感染性疾病到癌癥再到各種罕見疾病，mRNA在各種疾病中都顯示出潛在的治療價值。

然而，mRNA分子不穩定，易降解，通常需要對mRNA天然堿基進行修飾，如capping, tail, modification和replace。

例如，兩種正式推出的病毒mRNA疫苗的mRNA分子都進行了不同程度的特殊修飾。

這些特殊修改的效果如何?這也是科學家需要深入研究和解決的問題。準確定量的鑒定mRNA的修飾位點和修飾方法是深入分析mRNA修飾功能和機制的前提，也為提高mRNA的穩定性和效率提供了新的方向。

德國科隆大學的研究人員提出了一種對mRNA進行雙重化學修飾的策略，并評估了這些修飾對mRNA功能的影響。

在這項研究中，該團隊在mRNA轉錄過程中引入了第三個堿基對，將非自然的核苷酸引入到特定的位點，同時結合自然的mRNA修飾方法。

研究發現，雙化學修飾的mRNA可以形成協同效應，提高mRNA的穩定性、效率和蛋白表達。

本團隊利用該方法對mRNA進行標記，并進一步研究了人工修飾核苷酸對mRNA效率和穩定性的影響。

“我們研究了這種化學修飾的mRNA在細胞中的穩定性，合成的mRNA是否可以用作細胞中高效蛋白質生產的模板，以及化學修飾對翻譯成蛋白質的影響"，肖爾教授說:“研究結果表明，這種新方法在監測mRNA進入細胞、監測和影響其在細胞水平的傳播以及信息轉錄的效率方面非常有效。"

該研究成果已被《Chemical Science》雜志接受。

這項研究是由科隆大學有機化學研究所的斯蒂芬妮·卡特-肖爾教授領導的，她從2020年開始在科隆大學化學系擔任教授。

實驗室主要研究方向為核酸化學和化學生物學，包括功能RNA-核酸化學修飾、催化RNA和非編碼RNA功能研究。

根據研究小組的說法，這種方法有望為開發更有效的mRNA療法開辟新的可能性。

雙化學改性，達到協同增效

目前，有多種修飾技術可用于產生更穩定的mRNA，大致可分為三類：用人工合成的非天然核糖核酸代替天然核糖核酸合成mRNA；添加5′caps、3′poly（A）“尾"和UTR（未翻譯區）序列；并采用特殊的新型配方技術，有效保護mRNA。

其中，人工合成非天然核糖核酸取代天然核糖核酸合成mRNA是較為常用的方法之一。真核mRNA上的化學修飾大致可以分為三類:甲基化、偽尿苷(Ψ)和次嘌呤。

經過研究和工業應用，該方法可以降低mRNA固有的免疫原性和不穩定性。例如，Moderna和BioNTech的mRNA疫苗都使用偽尿嘧啶修飾來維持mRNA的穩定性。

隨著mRNA治療的不斷發展，學術界和工業界一直在尋找更多的改進方法，以提高mRNA的效率和穩定性。深入分析這些修飾對mRNA的功能影響，是控制mRNA結構、提高其穩定性和翻譯活性的重要基礎。

為了進一步研究這些化學修飾對mRNA的影響，Stephanie kat - schorr的團隊提出了結合位點特異性插入合成核苷酸和自然堿基修飾的想法。

在他們的實驗中，通過在DNA到RNA的酶轉錄過程中引入第三個堿基對，他們在3 ' -UTR處插入了合成的核苷酸，包含了Ψ和5mC(甲基化修飾)。，并設計了一系列實驗來觀察、量化和驗證mRNA的功能。

重要的是要注意,引入合成核苷酸通過基因轉錄(GENAEXT)字母擴張建立在以前的工作由各自的團隊一郎Hirao弗洛伊德Romesberg,他在2018年發表的研究指出,不自然的堿基對可以轉錄精度高、效率高。

在此基礎上，通過將功能化的非自然核苷酸具體引入長mRNA片段進行了改進。

在這項研究中，科隆大學團隊在體外合成了功能化和編碼蛋白質的GENAEXT mRNA，其中包括CP修飾，可以編碼紅色熒光報告蛋白mCherry。

具體包括在3 ' -UTR區域插入環丙烯(CP)， mRNA上Ψ和5mC修飾以提高其活性，以及引入5 ' cap和3 ' tail修飾。

然后，將修飾后的mRNA通過脂質體轉染到哺乳動物細胞中，通過逆轉錄定量PCR (RT-qPCR)分析mRNA水平和mCherry報告基因的表達，并與cp修飾的GENAEXT mRNA與未修飾的mRNA的翻譯效率進行比較。

數據表明，經過雙重化學修飾方法(自然堿基修飾和CP非自然堿基對插入)的mRNA在細胞內翻譯可以產生協同效應，這種合成的mRNA可以增加蛋白表達，提高轉染效率、有效性。

此外，cp修飾的mRNA在活細胞中通過反電子需求Diels-Alder (iEDDA)反應進行熒光標記。

用四嗪熒光團衍生物對合成的mRNA進行iEDDA處理后，研究人員可以通過共聚焦熒光顯微鏡觀察活細胞中的mRNA，同時也可以在時間和空間上跟蹤mRNA。

iEDDA:一種無催化劑的點擊反應(環加成反應)，具有生物相容性好、反應特異性高、反應速度快、毒性低等優點。

為了評估mRNA轉染過程中的細胞狀態和活細胞中的click反應，他們還進行了細胞活力測定。

釋放更多的mRNA潛能?

事實上，從mRNA序列進入細胞到引導細胞分泌蛋白質的過程存在許多困難，包括在進入細胞之前被無處不在的RNAse水解成小核苷酸分子;穩定表達,等等。

如前所述，利用人工合成的非天然核苷酸取代天然核苷酸合成mRNA已經是常用的mRNA修飾方法之一。

同時，通過在特定的mRNA片段中引入人工合成的非天然核苷酸，證明了修飾mRNA的可行性。在本研究中，該團隊將這兩種方法結合起來，提高了蛋白質合成效率和轉染效率。

因此，研究團隊認為，他們的實驗結果表明，GENAEXT方法的使用將為mRNA修飾的研究提供新的思路。

“這種方法可能為mRNA修飾開辟新的可能性微調mRNA的特性，并通過共價載體系統將mRNA高效傳遞到細胞中，"該團隊指出，他們已經通過一系列的研究表明，原則上，GENAEXT方法可以應用于任何長度的mRNA序列，而與四嗪衍生物的iEDDA click反應將使mRNA更功能化。

此外，該團隊認為，通過在mRNA的非翻譯區引入人工調節元件，調控mRNA翻譯水平的潛力可能被解鎖。

同時，他們提到，該方法除了能夠在細胞實驗中附著各種報告基團外，還具有應用于體外蛋白質結合實驗以鑒定mRNA結合蛋白的潛力。

此外，該團隊提出的方法還將為檢測修飾后mRNA的穩定性和表達效率提供一個新的“把柄"。目前，科學家們已經在定量和高通量兩個方向開發了多種方法。

更常用的方法包括通過結合特異性抗體的高通量富集，化學小分子/化學小分子衍生物的富集，以及特殊性質。測序技術。

對于下一個計劃，研究小組表示，他們正在開發更有效地包裝mRNA的方法，以更好地保護mRNA，使其順利進入細胞。