Western blot實驗過程中常見問題匯總及處理方案。

1、western blot 的優點及缺點

答： 優點：靈敏，特異性高，常規可達ng級，Ecl顯色法理論上可達pg 級。

     缺點：通量有限。

2、為什么我的細胞提取液中沒有目標蛋白？

答： 原因有很多：首先排除WB過程是不是抗體的問題，重新實驗、更換抗體；其次排除蛋白是否降解，提取的時候需要加入蛋白酶抑制劑， a) 你的細胞中不表達這種蛋白質，換一種細胞；最后考慮此種細胞是否表達該蛋白，表達量高低。

3、提取液有的有沉淀，有的很清亮，為什么呢？

答： a) 有沉淀可能因為你的蛋白沒有變性*，可以適當提高SDS 濃度，同時將樣品煮沸時間延長， b) 也不排除你的抗原濃度過高，這時再加入適量上樣緩沖液即可。

4、蛋白質分子量很小（10KD），WB實驗過程該注意哪些問題？

答：可以選擇0.2μm的PVDF膜，同時縮短轉膜時間。

5、目的條帶很弱，如何加強？

答：可以加大抗原上樣量，這是最主要的。同時也可以將一抗稀釋比例降低。

6、膠片背景很臟，解決方法？

答：減少抗原上樣量，降低一抗濃度，改變一抗孵育時間，提高封閉時間。

7、目標帶是空白，周圍有背景，是為什么？

答：你的一抗濃度較高，二抗上HRP 催化活力太強，同時你的顯色底物處于一個臨界點，反應時間不長，將周圍底物催化完，形成了空白即“反亮現象"。將一抗和二抗濃度降低，或更換新底物。

8、我的膠片是一片空白，是怎么回事？

答：如果能夠排除下面的幾個問題那么問題多半出現在一抗和抗原制備上。

a) 二抗的HRP 活性太強，將底物消耗光；

b) ECM底物中H2O2，不穩定，失活；

c) ECL底物沒覆蓋到相應位置；

d) 二抗失活。

9、我在顯影液中顯影1分鐘和5分鐘后,底片漆黑一片,是什么原因呢?

答：a) 可能膠片被曝光了，可以在*黑暗的情況下操作.看是否有改善.；b) 顯影時間過長。

10、DAB好還是ECM好？

答：DAB 有毒，但是比較靈敏，是HRP 最敏感的底物；ECM結果容易控制，但被催化時靈敏度差一點，但如果達到閥值，就特別靈敏，可以檢測pg 級抗原。要看你實驗的情況。

11、抗原檢測出的分子量比資料上的大，是怎么回事？

答：a)抗原形成了二聚體。增多巰基乙醇量，煮沸變性時間延長，可以打開二聚體。b)蛋白本身的修飾如：糖基化，磷酸化等。

12、蛋白轉移不到膜上，但膠上有，同時Marker 轉上去了，為什么？

答：可能是：a)樣品濃度過低；b)轉移時間不夠。

13、磷酸化抗體的檢測樣本制備時是否一定要加NaF等？

答：NaF是一種廣譜磷酸化酶的抑制劑，一般最好加。但是不加也可以，大部分時候是不用加的。

14、要驗證某個細胞上有無該蛋白的存在，需要做免疫組化和western blot試驗嗎？做這兩個試驗時的一抗和二抗可以共用嗎？

答： ① 免疫組化可以用來進行定位，但是不能精確定量，而且有時會有假陽性，不易與背景區分；Western blot可以特異性檢測某個蛋白質分子，進行定量，但是不能定位。

② 兩種實驗的一抗有時候不能通用，公司的產品說明一般都會說明可以進行什么實驗，在免疫組化時，是否適合石蠟切片或者冰凍切片。

15、做Western Blot時，提取蛋白后凍存（未加蛋白酶抑制劑），用的博士德的一抗，開始還有點痕跡，現在越來越差，上樣量已加到120μg，換了個santa cloz的一抗仍不行。是什么原因？蛋白酶抑制劑單加PMSF行嗎？

答：懷疑是樣品問題，可能是：

1，樣品不能反復凍融；

2，樣品未加蛋白酶抑制劑。同時，建議檢查Western Blot過程， 提高一抗濃度。對于加蛋白酶抑制劑來說，一般加PMSF就可以了，最好能多加幾中種蛋白酶抑制劑。

16、細胞水平要做western blot，多少細胞提的蛋白夠做western blot？

答：一般5×10^6就足夠了。

17、同一樣品能同時提RNA又提蛋白么？這樣對western blot有無影響？

答：能，沒有問題。有商品化的試劑盒可以滿足。

18、同一蛋白樣品能同時進行兩種因子的Western Blot檢測嗎？

答：當然可以，有的甚至可以同時測幾十種樣品。

19、如果目標蛋白是膜蛋白或是胞漿蛋白，操作需要注意什么？

答：如果是膜蛋白和胞漿蛋白，所用的去垢劑要溫和得多，這時最好加上NaF去抑制磷酸化酶的活性。

20、我的樣品的蛋白含量很低，每微升不到1微克，但是在轉膜時經常會發現只有一部分蛋白轉到了膜上，就是在轉膜后染膠發現有的孔所有的蛋白條帶都在，只是顏色變淡了，有什么辦法可以解決？

答：你可以加大上樣量，沒有問題，還有轉移時你可以用減少電流延長時間，加20％甲醇。