逆轉錄PCR

RT-PCR，逆轉錄PCR或稱反轉錄PCR（Reverse Transcription PCR），是聚合酶鏈式反應的一種廣泛應用的變形。在RT-PCR中，RNA在逆轉錄酶的作用下被逆轉錄成為互補DNA（complementary DNA，cDNA），再以此為模板通過PCR進行DNA擴增。

基本原理：

用逆轉錄酶以RNA為模板合成與其互補的DNA（cDNA）的過程。因為mRNA末端存在Poly A，所以用Oligo dT作為通用引物與其互補。商品化的反轉錄試劑盒里通常除了Oligo dT之外，還可以用隨機引物，但一般用Oligo dT引物就可以了。

重要參數(shù)：

不同mRNA拷貝成cDNA的效率不同；因此，適合于一種mRNA拷貝的條件可能對另一種mRNA不適合。一般來說，從事不均一mRMA群體時，所使用的條件是導致cDNA合成的終產量達到最大，下述參數(shù)十分重要。

1、逆轉錄酶： 有兩種不同的逆轉錄酶可以催化以mRNA為模板，oligo(dT)作為引物，合成與mRNA互補的cDNA鏈。一種來自純化的 AMV，由兩條肽鏈組成，具有聚合酶活性和很強的RNA酶H活性，它最適溫度是42℃，最適pH8.3。在高反應溫度時可消除mRNA的二級結構對逆轉錄的阻礙，然而高水平的RNA酶H的活性既抑制cDNA產生也限制其長度。另外，禽源逆轉錄酶制劑可被能切割DNA的核酸內切酶污染。

另一種是Mo-MLV，是單肽鏈的，有RNA聚合酶活性和相對較弱的RNA酶H活性，最適溫度37℃，最適pH7.6，較弱的RNA酶H活性對獲得2-3kb的mRNA的全長cDNA有很大好處。在第一鏈反應前可用氫氧化甲基汞處理，破壞mRNA的二級結構，這一步對于最適反應溫度較低(37)℃的鼠源逆轉錄酶催化的反應可能更為重要。臨合成cDNA第一鏈之前加入過量的巰基試劑，可以使氫氧化甲基汞從RNA上解離。

2、單價陽離子： 離子條件基本上影響各種模板的轉錄效率。用鉀比用鈉離子可獲得較長的轉錄產物。對于cDNA長度的最適鉀離子濃度為140-150mM。

3、二價陽離子： 對于反轉錄酶活性來說，二價陽離子是必需的。低于4mM Mg2 未能觀察到活性；產生全長轉錄產物的最適濃度是6-10mM。

4、脫氧核苷三磷酸： 使用四種脫氧核苷三磷酸(dNTP)中每一種的高濃度對于有效合成cDNA是特別重要的。如果其中只有一種的濃度下降到10-50微摩爾以下，全長轉錄物的產量將明顯下降。常用的dNTP的濃度為200-250微摩爾。

注意事項：

1、RNA 提取一定要迅速，樣本要新鮮，組織盡量在液氮中研磨；

2、RNA 提取完馬上進行逆轉錄不要拖延，新提的RNA很容易降解；

3、逆轉錄反應過程，需建立無RNAase環(huán)境，以避免模板RNA降解。